附錄B

（規(guī)范性附錄）

醫(yī)療廢物消毒處理效果微生物檢測程序和方法

B.1 醫(yī)療廢物高溫蒸汽消毒處理效果微生物檢測程序和方法

B.1.1 檢測材料

采用國家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)的生物內(nèi)含式生物指示劑。生物指示劑為嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.s tearothermophilus ATCC 7953），含菌量為5×105-×106cfu/片。

B.1.2 檢測方法

B.1.2.1 處理效果檢測應(yīng)采用符合《消毒技術(shù)規(guī)范》制作要求的嗜熱脂肪桿菌芽孢生物指示劑，并在其有效保質(zhì)期內(nèi)。

B.1.2.2 將多個(gè)生物指示劑菌管隨同醫(yī)療廢物，放置于殺菌室內(nèi)蒸汽處理效果最難保證的空間位置，或?qū)⒕芊胖迷诎b盒內(nèi)并裹挾進(jìn)醫(yī)療廢物中，在按照國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的滅菌參數(shù)下，進(jìn)行消毒處理。

B.1.2.3 消毒處理完畢后，取出指示菌劑，捏碎玻璃管，按照產(chǎn)品規(guī)定的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)（如無特殊說明，培養(yǎng)溫度為56℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h），同時(shí)以沒有經(jīng)歷消毒處理的生物指示劑菌管做對照，并觀察培養(yǎng)基顏色變化。試驗(yàn)重復(fù)3次。

B.1.3 消毒效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以經(jīng)過消毒的陰性菌管與陽性對照菌管的顏色變化相同與否判斷是否到達(dá)消毒效果要求，陰陽對照菌管顏色變化相同或都不發(fā)生變化，說明消毒不合格；顏色變化不同，說明消毒合格。

B.2 醫(yī)療廢物化學(xué)消毒處理效果微生物檢測程序和方法

B.2.1 檢測材料

B.2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）。

B.2.1.2 消毒因子：化學(xué)消毒劑。

B.2.1.3 中和劑：根據(jù)不同的化學(xué)消毒劑選擇適宜的中和劑。

B.2.1.4 稀釋液：胰蛋白胨生理鹽水溶液。

B.2.1.5 培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基。

B.2.1.6 染菌載體：管長為2cm，內(nèi)徑為4mm的輸液管。

B.2.1.7 模擬醫(yī)療廢物的成分大致包括：5％的有機(jī)原料（如漢堡包、肉包子、饅頭）和95%塑料、纖維素和玻璃等。模擬醫(yī)療廢物的總投加重量應(yīng)大于或等于實(shí)際應(yīng)用中的最大負(fù)荷重量。

B.2.1.8 模擬殺菌因子：粉劑化學(xué)消毒劑（如石灰粉）可采用滑石粉；液體化學(xué)消毒劑（如次氯酸鈉、二氧化氯等）可采用去離子水。

B.2.1.9 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所用器材，參考《消毒技術(shù)規(guī)范》。

B.2.2 檢測方法

B.2.2.1 枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）的制備按照《消毒技術(shù)規(guī)范》相關(guān)方法制備枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）懸液。

B.2.2.2 染菌樣本的制備方法

a）用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)配制成含芽孢懸液濃度為108-1010cfu/mL的TSB芽孢懸液。

b）將輸液管放入裝有芽孢懸液的容器中，攪拌，使其充分接觸并浸泡5min后，將輸液管放在消毒大搪瓷盤中，置于37℃恒溫箱中烘干，制成染菌載體備用，使每克樣本的回收芽孢數(shù)量在5×105-5×106cfu。

B.2.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

按《消毒技術(shù)規(guī)范》中的方法進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。

B.2.4 處理效果檢測實(shí)驗(yàn)

B.2.4.1 對照組操作步驟

a）處理過程：將一定數(shù)量染菌樣本與待消毒的模擬醫(yī)療廢物混合投加到預(yù)先已清潔過（未受到污染）的醫(yī)療廢物處理設(shè)備中，并按設(shè)備操作說明書的劑量要求和方法，在最大負(fù)荷量（滿載）的情況下，加入模擬殺菌因子作為對照組進(jìn)行處理。

b）采樣：醫(yī)療廢物處理過程結(jié)束后，在設(shè)備出口排出的醫(yī)療廢物殘?jiān)惺占欢〝?shù)量的樣品。

從收集樣品中揀出染菌樣本，取1g-2g，以無菌操作方式，用剪刀剪碎后加到裝有20mL中和劑的離心管中，作用10min，將離心管用手振打200次，并做10倍系列稀釋，選取適宜稀釋度，分別吸取1mL，以傾注法接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

B.2.4.2 實(shí)驗(yàn)組操作步驟

在最大負(fù)荷量（滿載）的情況下，將模擬殺菌因子改為化學(xué)消毒劑，其余操作步驟包括采樣過程均與對照組操作步驟相同。對照組和實(shí)驗(yàn)組試驗(yàn)均重復(fù)3遍。

B.2.4.3 陰性對照組操作步驟

試驗(yàn)結(jié)束后，將用過的同批次中和劑、洗脫液和稀釋液接種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；另將未用過的同批次培養(yǎng)基放入恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，作為陰性對照。

B.2.5 殺滅對數(shù)值的計(jì)算方法

每克樣本菌落數(shù)：（A×B×C）/D

A為每平板平均菌落數(shù)；B為稀釋度；C為樣本洗液體積（mL）；D為樣本的重量（g）；殺滅對數(shù)值（KL）=No－NxNo為對照組每克樣本菌數(shù)的對數(shù)值；Nx為實(shí)驗(yàn)組每克樣本菌數(shù)的對數(shù)值。

B.2.6 消毒效果評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

在3次試驗(yàn)中，對照組細(xì)菌芽孢數(shù)量應(yīng)在5×105-5×106cfu/g，各次試驗(yàn)的殺滅對數(shù)值均≥4.00，陰性對照組均無菌生長，可判為消毒合格。

B.3 醫(yī)療廢物微波消毒處理效果微生物檢測程序和方法

B.3.1 檢測材料

B.3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）或嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.stearothermophilus ATCC 7953）。

B.3.1.2 染菌載體：10mm×10mm 布片。

B.3.1.3 微波漏能檢測儀（檢測消毒倉室微波有無泄漏）。

B.3.1.4 培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基。

B.3.1.5 洗脫液：胰蛋白胨生理鹽水溶液。

B.3.1.6 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所用器材：參考《消毒技術(shù)規(guī)范》。

B.3.2 檢測方法

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》相關(guān)方法制備枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）和嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.stearothermophilus ATCC 7953）菌片。

編輯：趙凡